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細菌RNA提取試劑盒說明書

RNApure Bacteria Kit

細菌RNA提取試劑盒

Cat. No.   K0536

保存：室溫

組分說明

                                              Cat. No.              K0536

                                              Kit Size                 50

                                             Buffer RL               35 ml

                                            Buffer RW1               40 ml

                                    Buffer RW2（concentrate）          11 ml

                                        RNase-Free Water             10 ml

                                      Shredder Spin column             50

                                         Spin Column RM                50

                                    Collection Tube（1.5 ml）            50

                                     Collection Tube（2 ml）            100

產品簡介

     本試劑盒采用高效、專一結合核酸的離心吸附柱和*的緩沖系統，可從細菌或培養的動物細胞中快速提取總 RNA，30-40 分鐘內即可完成反應。提取的總RNA 純度高，沒有蛋白質和其他污染，如果是對微量 DNA 非常敏感的 RNA 實驗，殘留的DNA 可利用無 RNase 的 DNase I 在柱上進行消化去除。提取的RNA 適用于RT-PCR、Real-Time RT-PCR、芯片分析、體外翻譯等實驗。

注意事項

1.預防RNase污染，應注意以下幾方面：

1）使用無RNase的塑料制品和槍頭，避免交叉污染。

2）玻璃器皿應在使用前于180℃高溫下干烤4小時，塑料器皿可在0.5 M NaOH中浸泡10分鐘，用水*沖洗后高壓滅菌。

3）配制溶液應使用無RNase的水。

4）操作人員戴一次性口罩和手套，實驗過程中要勤換手套。

2. 提取的樣品避免反復凍融，否則影響RNA提取的量和質量。

3. 使用前請檢查 Buffer RL 是否出現結晶或者沉淀，可置于 56℃水浴重新溶解。Buffer RL 在使用前請加入β-巰基乙醇，

    至終濃度為 1%。如 1 ml Buffer RL 加 10 μl  β-巰基乙醇。加入β-巰基乙醇的 Buffer RL 室溫可保存 1 個月。

4. 第一次使用前應按照試劑瓶標簽的說明先在 Buffer RW2 中加入無水乙醇。

5. 所有離心步驟若無特殊說明均在室溫下進行，且所有操作步驟動作要迅速。

6. 若下游實驗對 DNA 非常敏感，建議用不含 RNase 的 DNase I（貨號：K2090A）對 RNA 進行處理。

自備試劑：Lysozyme（K0887）、TE緩沖液、β-巰基乙醇、無水乙醇（新開封或提取RNA專用）  

操作步驟

 1. 4℃  10,000 rpm（~13,400×g）離心2分鐘收集菌體（菌體量最大不超過1×10⁹ ），小心去除所有上清。

     注意：上清如果有殘留，會影響后續的消化過程。

 2. 用含有Lysozyme的100  μl TE緩沖液*重懸菌體，室溫孵育。具體配方和孵育時間如下：

TE 緩沖液中 Lysozyme 的終濃度            孵育時間

G 細菌                  400  μg/ml              3-5 分鐘

                          -

G+ 細菌                3 mg/ml                   5-10 分鐘

3. 加入350  μl Buffer RL（使用前請檢查是否加入β-巰基乙醇），渦旋震蕩混勻（此步驟可能出現不溶性沉淀）。將溶液與沉淀全部加入到已裝入收集管（Collection Tube 2 ml）的過濾柱（Shredder Spin Column）中，10,000 rpm離心2分鐘，收集濾液，棄掉過濾柱。

 4. 向上步得到的濾液中加入250  μl無水乙醇，混勻（此時可能會出現沉淀）。將得到的溶液和沉淀一起轉入到已裝入收集管（Collection Tube 2 ml）的吸附柱（Spin Column RM）中，10,000 rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

 5. 向吸附柱中加入700  μl Buffer RW1，10,000 rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

可選步驟：如果要進行對微量DNA非常敏感的RNA實驗，則用以下步驟替代步驟5。

     1）向吸附柱中加入350  μl Buffer RW1，10,000 rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

     2）配制DNase I  混合液：取52 μl RNase-Free Water，向其中加入8  μl 10 × Reaction Buffer  和20 μl DNase I（1 U/μl），混勻，  配制成終體積為80  μl的反應液。

       注意:  以上體系為按照我公司產品DNase I （YJ2090A）反應體系進行配置，應用其他公司產品請參考相應說明書。

    3）向吸附柱中直接加入80 µl DNase I  混合液，20-30℃孵育15分鐘。

    4）向吸附柱中加入350  μl Buffer RW1, 10,000 rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

 6. 向吸附柱中加入500  μl Buffer RW2（使用前檢查是否加入無水乙醇）, 10,000 rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

 7. 重復步驟6。

 8. 12,000 rpm 離心 2 分鐘，倒掉收集管中的廢液。將吸附柱置于室溫數分鐘，以*晾干。

     注意：這一步的目的是將吸附柱中殘余乙醇去除，乙醇殘留會影響后續的酶促反應(酶切、PCR等)。

 9. 將吸附柱置于一個新的無RNase的離心管（Collection Tube 1.5 ml）中，向吸附柱的中間部位加入30-50  μl

      RNase-Free Water，室溫放置1分鐘，10,000 rpm離心1分鐘，收集RNA溶液，-70℃保存RNA，防止降解。

注意：1）  RNase-Free Water 體積不應小于 30 μl，體積過小影響回收率。

2）如果要提高RNA的產量，可用30-50 μl新的RNase-Free Water重復步驟9。

3）如果要提高RNA濃度，可將得到的溶液重新加入到吸附柱中，重復步驟9。

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